在氨基酸分析仪的检测系统中，柱后衍生是将经色谱柱分离后的氨基酸转化为可被高灵敏度检测的衍生物的关键步骤，而荧光检测则是通过捕捉衍生物的荧光信号实现氨基酸定量分析的核心手段。二者结合可解决“游离氨基酸本身荧光信号弱、难以直接高灵敏检测”的问题，是现代氨基酸分析（尤其是痕量分析）的主流技术组合，其原理可拆解为“柱后衍生反应机制”和“荧光检测光学原理”两部分，具体如下：
一、柱后衍生的原理：将“难检测氨基酸”转化为“易检测衍生物”
氨基酸分子（除色氨酸外）本身缺乏强紫外吸收或荧光发射基团，直接检测时灵敏度极低（无法满足μg/L级痕量分析需求）。柱后衍生的核心逻辑是：让经离子交换色谱柱（氨基酸分析常用分离模式）分离后的氨基酸，在流出柱后与特定“衍生试剂”发生化学反应，生成具有强荧光（或强紫外吸收）的稳定衍生物，为后续高灵敏检测创造条件。
1.核心流程：分离→混合→反应→检测
柱后衍生系统由“衍生试剂储存罐、混合器、反应盘管、控温装置”组成，具体步骤为：
氨基酸分离：样品中的多种氨基酸经离子交换柱（如磺酸基阳离子交换树脂）分离，因不同氨基酸与树脂的亲和力差异，按特定顺序依次从柱中流出；
试剂混合：分离后的氨基酸流（流动相+氨基酸）与衍生试剂流（如茚三酮、邻苯二甲醛OPA、9-芴甲基氯甲酸酯FMOC）通过“T型混合器”充分混合；
恒温反应：混合液进入“控温反应盘管”（通常30-130℃，依试剂而定），在特定温度下发生衍生反应，生成荧光衍生物；
进入检测：反应后的衍生物直接流入荧光检测器，进行信号捕捉。
二、荧光检测的原理：捕捉衍生物的荧光信号，实现定量分析
荧光检测基于“光致发光”现象：当荧光衍生物受到特定波长的光（激发光）照射时，分子中的电子吸收能量跃迁到高能级，随后通过非辐射跃迁释放部分能量，再跃迁回基态并发射出特定波长的光（荧光）。荧光检测器通过“激发光过滤、荧光收集、信号转换”，将荧光强度转化为电信号，最终实现氨基酸的定量分析。
1.荧光检测器的核心结构与工作流程
荧光检测器主要由“光源、激发单色器、样品池、发射单色器、光电倍增管（PMT）、信号处理器”组成，具体步骤如下：
激发光产生：光源（常用氙灯，可提供200-800nm连续光谱）发出的复合光，经“激发单色器”（由光栅和狭缝组成）过滤，仅保留与衍生物“激发波长”匹配的单色光（如OPA衍生物对应340nm激发光）；
荧光激发与发射：激发光穿过样品池（流经的是柱后衍生后的衍生物溶液），衍生物分子吸收能量后发射荧光（荧光方向与激发光垂直，避免激发光干扰）；
荧光过滤与收集：发射的荧光经“发射单色器”过滤（去除杂散光和未被吸收的激发光），仅保留与衍生物“发射波长”匹配的单色光（如OPA衍生物对应450nm发射光）；
信号转换与定量：过滤后的荧光被“光电倍增管（PMT）”接收，PMT将微弱的光信号转化为成比例的电信号（电流或电压），再经信号处理器放大、模数转换后，生成“荧光强度-保留时间”的色谱图；
定量依据：根据“朗伯-比尔定律的荧光延伸形式”——在一定浓度范围内，荧光衍生物的荧光强度与氨基酸的浓度成正比，通过对比“标准氨基酸衍生物的荧光强度（标准曲线）”与“样品衍生物的荧光强度”，即可计算出样品中各氨基酸的浓度。
2.荧光检测的核心优势：高灵敏度与高特异性
相较于紫外吸收检测，荧光检测在氨基酸分析中具备不可替代的优势，这也是柱后衍生常与荧光检测联用的核心原因：
高灵敏度：荧光检测的检出限（LOD）可达nmol/L甚至pmol/L级（比紫外检测低1-3个数量级），能检测生物样品（如血液、尿液）中痕量的氨基酸（如代谢异常导致的微量氨基酸升高）；
高特异性：仅能检测“能产生荧光的衍生物”，而流动相、杂质（若不与衍生试剂反应）几乎无荧光信号，可有效避免杂峰干扰（如食品中蛋白质水解后的氨基酸分析，无需复杂前处理除杂）；
线性范围宽：在10⁴-10⁵的浓度范围内，荧光强度与氨基酸浓度呈良好线性关系，适用于不同含量样品（从微量到常量）的定量。
三、柱后衍生与荧光检测的协同逻辑（为什么必须结合？）
二者的结合完美解决了氨基酸检测的“分离-检测”痛点，形成闭环：
分离后衍生，避免干扰：柱后衍生在氨基酸经色谱柱分离后进行，衍生试剂不会与样品中的杂质（如蛋白质、盐类）反应（杂质已被色谱柱分离或不具备氨基），避免“衍生杂质影响分离”（柱前衍生可能因衍生产物与杂质共洗脱导致峰重叠）；
衍生后荧光，提升灵敏度：通过衍生将“无荧光的氨基酸”转化为“强荧光衍生物”，让荧光检测能捕捉到微弱信号，满足痕量分析需求（如临床诊断中氨基酸代谢谱的精准检测）；
信号与浓度挂钩，实现定量：荧光强度与衍生物浓度（即原氨基酸浓度）成正比，结合标准曲线可准确定量各氨基酸含量，结果重复性好（RSD通常<2%）。
更新时间：2025-09-29
点击次数：347
当前位置：
氨基酸分析仪
