柱后衍生光度法是将高效液相色谱（HPLC）分离与柱后衍生反应结合，通过衍生试剂与目标物反应生成可被光度检测器（紫外-可见、荧光）检测的衍生物，从而提升检测灵敏度与选择性，广泛应用于食品、环境、医药、化工等领域的痕量物质分析。以下是其标准化、可直接操作的具体步骤，涵盖从前期准备到数据处理的全流程：
一、实验前准备
1.仪器与耗材准备
核心仪器：高效液相色谱仪（含输液泵、色谱柱、柱温箱）、柱后衍生系统（衍生试剂泵、反应盘管/反应器、温控模块）、光度检测器（UV-Vis/荧光检测器，根据衍生物特性选择）、数据处理工作站。
关键耗材：适配目标物的HPLC色谱柱（如C18反相柱、氨基柱、离子交换柱，依分离机理选择）、衍生反应盘管（常用不锈钢/PEEK材质，长度0.5~10m，内径0.25~0.5mm，长度影响反应时间）、管路接头（无死体积设计，避免峰展宽）、滤膜（0.22/0.45μm水系/有机系）、样品瓶、容量瓶、移液管等。
辅助设备：超声波清洗仪、真空泵、电子天平、pH计、恒温水浴锅。
2.试剂与溶液配制
流动相：根据色谱柱类型与目标物性质配制，如反相体系用甲醇-水、乙腈-水，离子对体系添加离子对试剂，需调节pH（用磷酸、乙酸、三乙胺等），经0.22μm滤膜过滤并超声脱气10~15min，去除气泡避免泵压波动。
衍生试剂：按方法要求精准配制，需严格控制浓度、pH、纯度，部分试剂（如邻苯二甲醛、茚三酮、铜试剂）需现配现用，避光低温保存；衍生试剂需过滤脱气，通过柱后试剂泵恒压/恒流输送。
标准溶液：用标准品配制梯度浓度的标准储备液与工作液，溶剂与流动相/样品基质匹配，用于后续校准与定量。
样品前处理试剂：提取剂、净化剂（如固相萃取填料）、缓冲盐等，依样品基质（食品、水样、生物样品）选择。
3.仪器预热与参数预设
开启HPLC主机、柱后衍生系统、检测器与工作站，预热30~60min，确保各模块稳定；
预设核心参数：
色谱部分：流动相流速（常规0.8~1.5mL/min）、柱温（25~40℃，依色谱柱耐受度）、检测波长（根据衍生物最大吸收/发射波长设定，如氨基酸衍生后紫外338nm、荧光激发340nm/发射450nm）；
柱后衍生部分：衍生试剂泵流速（0.1~0.5mL/min，与流动相流速匹配，保证混合比例稳定）、反应盘管温度（室温～120℃，依反应动力学设定，如茚三酮衍生需100~120℃加热）、反应时间（由盘管长度与总流速决定，通常30s~5min，保证反应完全）；
检查管路连接：流动相管路、衍生试剂管路、反应盘管、检测器管路无泄漏、无气泡，接头拧紧无死体积。
二、系统平衡与空白测试
1.系统平衡
启动流动相泵，以预设流速冲洗色谱柱与管路，待柱压、基线稳定（基线漂移≤0.1mV/min，噪声≤0.05mV）；
启动柱后衍生试剂泵，使衍生试剂与流动相在柱后混合器充分混合，流经反应盘管后进入检测器，继续平衡系统，直至衍生反应后的基线无杂峰、无漂移，确保无试剂干扰、反应体系稳定。
2.空白实验
注入空白溶剂（与样品、标准品溶剂一致），运行完整分析方法，记录空白色谱图；
空白图谱应无明显杂峰，或杂峰不干扰目标物出峰，若存在干扰峰，需排查流动相、衍生试剂纯度、管路污染、色谱柱残留等问题，更换试剂或冲洗系统后重新平衡。
三、校准曲线绘制
依次注入不同浓度的标准工作液，每个浓度重复进样2~3次，记录目标物衍生物的色谱峰面积/峰高；
以标准品浓度为横坐标，峰面积/峰高为纵坐标，通过工作站绘制校准曲线，计算回归方程与相关系数（R²≥0.999为合格，保证定量准确性）；
验证曲线线性范围，确保待测样品浓度落在曲线线性区间内，超出则稀释后重新检测。
四、样品检测
1.样品前处理
提取：根据样品基质，采用溶剂萃取、超声提取、微波提取等方法，将目标物从基质中分离；
净化：通过固相萃取（SPE）、液液萃取、离心过滤等方式，去除基质干扰物（如蛋白质、色素、油脂），避免污染色谱柱与干扰衍生反应；
定容：将净化后的样品用空白溶剂定容，经0.22μm滤膜过滤后转移至样品瓶，待测。
2.进样分析
将处理好的样品注入液相色谱仪，运行预设分析方法，流动相携带样品经色谱柱分离，各组分依次流出；
流出组分与柱后衍生试剂在混合器中混合，进入温控反应盘管完成衍生反应，生成具有强吸光度/荧光的衍生物；
衍生物进入光度检测器，产生响应信号，工作站实时记录色谱图，获取目标物的保留时间、峰面积/峰高。
每个样品重复进样2~3次，取平均值，保证结果重复性。
五、数据处理与结果计算
根据样品色谱图中目标物的保留时间，与标准品比对进行定性分析，确认目标物峰；
将样品峰面积/峰高代入校准曲线回归方程，计算样品中目标物的浓度；
结合样品前处理的稀释倍数、取样量，换算出原始样品中目标物的实际含量；
计算重复性（相对标准偏差RSD≤5%）、回收率（80%~120%为合格），验证方法可靠性。
六、实验后系统维护
色谱柱冲洗：检测结束后，用对应冲洗溶剂（反相柱用甲醇、乙腈，离子交换柱用缓冲盐-水）冲洗色谱柱30~60min，去除残留基质与衍生试剂，再用保存溶剂冲洗后密封保存；
柱后衍生系统清洗：用纯水/甲醇冲洗衍生试剂泵、混合器、反应盘管管路，清除残留试剂，避免管路堵塞、试剂结晶腐蚀；长期不用时，用惰性溶剂密封管路；
检测器与工作站：关闭检测器光源，退出工作站，关闭仪器电源，清洁仪器表面；
试剂与耗材处理：剩余衍生试剂、流动相按实验室危废规范处理，一次性耗材分类回收，玻璃器皿清洗烘干备用。
七、关键注意事项
气泡控制：全程避免管路、泵内产生气泡，流动相、衍生试剂必须充分脱气，泵启动时先排气；
反应条件精准控制：衍生试剂流速、反应温度、时间需严格恒定，温度波动、流速偏差会直接导致衍生物生成不稳定，峰面积漂移；
试剂稳定性：易氧化、易降解的衍生试剂需现配现用，避光保存，定期更换；
基质干扰：复杂基质样品需强化净化步骤，避免基质与衍生试剂反应产生杂峰，干扰定量；
管路材质：衍生试剂若含酸碱、有机溶剂，需选用PEEK、不锈钢等耐腐管路，避免管路溶出干扰。
更新时间：2026-02-02
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